[简答题]试述如何以质粒为载体克隆一个编码植物激素合成酶的基因，并使之在E.coli中表达应注意哪些问题才能完成基因的表达通过哪些途径可提高克隆基因的表达效率

参考答案:欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和SD序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件。也就是说：(1)通过原核表达载 体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；(2)外源基因不能带有内含子，用cDNA；(3)必须利用原核细胞强启动子和SD序列等调控元件控制表达；(4)外源基因连入表达载体后，必须形成正确的开放阅读框；(5)利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达产物对宿主菌的毒害；(6)选用合适的突变型宿主，防止产生的真核生物的蛋白产物被细菌的蛋白酶识别和降解；(7)如果该合成酶是通过前体分子加工而来的，则可以用合成基因，从而免除加工过程。
提高克隆基因表达效率的途径：
(1)选用强启动子以提高表达效率。如tac启动子；(2)转译起始序列影响表达效率，连接SD序列后的4个碱基成分如由4个A(T)碱基组成，翻译作用最有效；(3)启动子与克隆基因间的距离影响表达效率，采用构建克隆库的方法提高表达效率；(4)转录终止区对表达效率也有影响，在克隆基因末端存在一个终止区可以保证表达效率维持在一个正常的水平上；(5)质粒拷贝数及稳定性对表达效率有影响，将基因克隆到高拷贝数的质粒载体上，可提高mRNA分子的数量，提高翻译的效率；(6)调整SD序列与AuG间的距离，增加mRNA的稳定性以提高翻译水平；(7)减轻细代谢负荷，如诱导表达，使外源基因的表达与细菌的生长分开，从而减少细胞代谢的损伤，以免影响外源基因的表达；(8)提高表达蛋白的稳定性，防止其降解。如表达融合蛋白的措施；或选
用突变菌株的措施等。