[简答题]说明mRNA差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。

参考答案: 原理：
①几乎所有的真核基因mRNA分子的3´-末端都有一段poly（A）尾巴。因此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA拷贝；
②根据mRNA分子3´-端序列结构分析，在这段poly（A）序列起点碱基之前的两个碱基，除了倒二位的碱基为A的情况之外，只能有12种可能的排列组合；
③根据上述mRNA分子结构特征设计的，用以反转录mRNA合成第一链cDNA的下游引物，共12种，其通式为：5´-T11MN或5´-T12MN。每一种此类人工合成的3´-端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂种分子。因此，用5´-T11MN引物或5´-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。
④由于3´-端锚定引物合成的第一链cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要进行PCR扩增，因此在DDRT-PCR反应中还需5´-端随机引物。
优点：
①可以同时比较多个样品间基因表达的差异；
②可以同时检测到“上游”及“下游”基因；
③检测的灵敏度高，所需样品少，一些低丰度的mRNA亦可被检测出来；
④结合使用PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本法更加简单方便。
缺点：
①假阳性比较高，通常可高达50%-70%；
②扩增条带的分子长度比较短小；
③工作量大。