第29题:[简答题]简述实时荧光定量PCR中荧光染料技术的原理和优缺点 参考答案:荧光染料技术也称为DNA交联荧光染料技术。目前主要应用的染料分子是SYBR GREEN I, SYBR GREEN I是一种可以非特异地结合双链DNA小沟的荧光染料,它嵌合进 DNA双链,但不结合单链。在PCR反应体系中加入过量SYBRGREEN I染料,游离的过量 SYBR GREEN I染料几乎没有荧光信号,但当该染料能选择性地掺入至双链DNA分子中, 将会产生很强的荧光信号。在PCR扩增过程中,由于新合成的双链DNA不断增加,SYBR GREEN I染料结合到双链DNA分子中也增加,因此,PCR扩增的产物越多,SYBR GREEN I 则结合的越多,荧光信号就越强。
该技术的优点在于荧光染料的成本低,同时不需要对引物或探针进行预先特殊的荧光 标记,适用于任何反应体系,操作亦比较简单,因此在科学研究中该技术应用得更为广泛。
然而由于SYBR GREEN I染料能与任何双链DNA结合,因此,它也会结合到非特异性扩增 产生的双链分子或引物二聚体中,使实验产生假阳性信号。非特异性扩增产生的双链分子 和引物二聚体所致的非特异的荧光信号目前可以通过恪解曲线(MELTING CURVE)来区分特异 性和非特异性扩增。另外,通过选择合适的引物和优化反应体系也有助于减少非特异的荧 光信号。总体来说,SYBR GREEN I是一种最基础的实验手段在许多方面已有应用。 DNA交联荧光染料技术#主要应用的染料分子是SYBR Green I#非特异地结合双链DNA小沟#荧光染料#嵌合进DNA双链#但不结合单链#在PCR反应体系中加入过量SYBRGreen I染料#游离的过量SYBR Green I染料几乎没有荧光信号#但当该染料能选择性地掺入至双链DNA分子中#将会产生很强的荧光信号#在PCR扩增过程中#由于新合成的双链DNA不断增加#SYBR Green I染料结合到双链DNA分子中也增加#PCR扩增的产物越多#SYBR Green I 则结合的越多#荧光信号就越强#优点#荧光染料的成本低#不需要对引物或探针进行预先特殊的荧光标记#适用于任何反应体系#操简单#应用广泛#也会结合到非特异性扩增产生的双链分子或引物二聚体中#使实验产生假阳性信号#非非特异的荧光信号可以通过融解曲线来区分#选择合适的引物和优化反应体系也有助于减少非特异的荧 光信号